Kako se ove endonukleaze ističu
Koliko znate o enzimima za ograničenje? Dobijete bolje razumevanje onoga što rade i zašto su važne, sa ovim pregledom.
Definiranje restrikcijskih enzima
Restriktivne endonukleaze su klasa enzima koji smanjuju molekule DNK. Svaki enzim prepoznaje jedinstveni niz nukleotida u DNK sklopu. Takve sekvence su obično oko 4 do 6 baznih parova. Sekvence su palindromske jer komplementarna DNA dužina ima isti niz samo u suprotnom pravcu.
Drugim riječima, oba dna DNK-a sekaju na istoj lokaciji.
Gde se nalaze ovi enzimi
Restriktivni enzimi nalaze se u mnogim različitim vrstama bakterija u kojima je njihova biološka uloga učešća u odbrani ćelije. Ovi enzimi "ograničavaju" stranu (npr. Virusnu) DNK koja ulazi u ćeliju, uništavajući ih. Ćelija domaćin ima sistem za modifikaciju ograničenja koji metiluje sopstvenu DNK na mestima specifičnim za svoje odgovarajuće enzime za ograničenje, čime ga štiti od cepanja. Otkriveno je više od 800 poznatih enzima koje prepoznaju više od 100 različitih nukleotidnih sekvenci.
Upotreba u biotehnologiji
Restriktivni enzimi se koriste u biotehnologiji kako bi se smanjila DNK u manje pramene, kako bi se proučile razlike dužine fragmenata među pojedincima (Polimorfizam dužine fragmentacije fragmenta - RFLP). Koriste se i za kloniranje gena.
RFLP tehnike su korišćene kako bi se utvrdilo da pojedinci ili grupe pojedinaca imaju značajne razlike u sekvencama gena i uzorcima ograničenja rasta u određenim oblastima genoma.
Poznavanje ovih jedinstvenih oblasti je osnova za otiske prstiju . Svaka od ovih metoda zavisi od upotrebe elektroforeze agaroznog gela za odvajanje fragmenta DNK. TBE pufer, koji se sastoji od baze Tris, borne kiseline i EDTA, najčešće se koristi za elektroforezu agaroznog gela za ispitivanje DNK proizvoda.
Vrste ograničenja enzima
Postoje tri različita tipa restrikcijskih enzima. Tip I odseče DNK na nasumičnim lokacijama do 1000 ili više baznih parova sa mjesta prepoznavanja. Tip III seče na oko 25 baznih parova sa lokacije. Vrste I i III zahtevaju ATP i mogu biti veliki enzimi sa više podjedinica. Enzimi tipa II, koji se pretežno koriste u biotehnologiji, smanjuju DNK unutar prepoznate sekvence bez potrebe za ATP i manji su i jednostavniji.
Enzimi za restrikciju tipa II se imenuju prema bakterijskim vrstama iz kojih su izolovani. Na primer, enzim EcoRI je izolovan iz E. coli . Većina ljudi je upoznata sa epidemijama E. coli u hrani.
Enzimi za ograničenje tipa II mogu generisati dva različita tipa rezova u zavisnosti od toga da li su obojice urezali u centar sekvence prepoznavanja ili svake niti bliže jednom kraju prepoznatljive sekvence.
Prvi rez će generisati "tupe ciljeve" bez nukleotidnih nadvišaja. Drugi generiše "lepljive" ili "kohezivne" krajeve, jer svaki od posledičnih fragmenata DNK ima nadvišenje koje komplimira druge fragmente. Oba su korisna u molekularnoj genetici za pravljenje rekombinantne DNK i proteina.
Ovaj oblik DNK se izdvaja iz razloga što je proizveden ligacijom (povezivanjem) dve ili više različitih žica koje nisu izvorno povezane zajedno.