Kloniranje gena je čin stvaranja kopija ili klona jedinstvenog gena. Jednom kada se identifikuje gen, klonovi se mogu koristiti u mnogim oblastima biomedicinskih i industrijskih istraživanja. Genetički inženjering je proces kloniranja gena u nove organizme ili promena sekvence DNK za promenu proteinskih proizvoda. Genetski inženjering zavisi od naše sposobnosti da izvršimo sledeće bitne procedure.
01 Reakcija lanca polimeraze
02 Ograničenja enzima
Otkriće enzima poznatih kao restrikcione endonukleaze bio je od suštinskog značaja za inženjering proteina . Ovi enzimi su rezali DNK na određenim lokacijama na osnovu nukleotidne sekvence. Stotine različitih enzima restrikcije , sposobnih za rezanje DNK na različitim mestima, izolovane su od mnogih različitih vrsta bakterija. DNK rezana sa restrikcionim enzimom proizvodi mnogo manjih fragmenata različitih veličina. Ove se mogu odvojiti koristeći gel elektroforezu ili hromatografiju.
03 Elektroforeza
Pročišćavanje DNK iz ćelijske kulture ili njegovo rezanje pomoću enzima restrikcije ne bi bilo od velike koristi ako ne bi mogli da vizuelizujemo DNK - tj. Pronaći način da vidite da li vaš ekstrakt sadrži bilo šta ili u kojoj meri vam fragmentira Prešao sam. Jedan od načina za to je gel elektroforeza. Gelovi se koriste u različite svrhe, od gledanja rezane DNK do detekcije DNK umetaka i noktiju.
04 Pridružite se dvema komadima DNK
U genetskom istraživanju, često je neophodno povezati dve ili više pojedinačnih ćelija DNK-a, da bi se stvorio rekombinantni deo ili zatvori kružnu žicu koja je isečena restrikcionim enzimima. Enzimi zvani DNK ligaze mogu stvoriti kovalentne veze između nukleotidnih lanaca. Enzimi DNK polimeraza I i polinukleotidna kinaza takođe su važni u ovom procesu, za popunjavanje praznina ili fosforilaciju 5 'krajeva, respektivno.
05 Izbor male samorepekcione DNK
Mali kružni delovi DNK koji nisu deo bakterijskog genoma, ali su sposobni za samoprijavanje, poznati su kao plazmidi. Plazmidi se često koriste kao vektori za transport gena između mikroorganizama. U biotehnologiji, kada je gen koji je interesantan amplifikovan, a gen i plazmid su presječeni enzimima restrikcije, oni se ligiraju zajedno stvarajući ono što je poznato kao rekombinantna DNK. Virusna (bakteriofagna) DNK se takođe može koristiti kao vektor, kao i kosmidi, rekombinantni plazmidi koji sadrže gene bakteriofaga.
06 Metoda za pomeranje vektora u ćeliju domaćina
Proces prenošenja genetskog materijala na vektor kao što je plazmid, u nove ćelije domaćina naziva se transformacija. Ova tehnika zahteva da ćelije domaćina budu izložene promeni u okolini što ih čini "kompetentnim" ili privremeno propustljivim za vektor. Elektroporacija je jedna takva tehnika. Što je veći plazmid, to je niža efikasnost koju uzimaju ćelije. Veći segmenti DNK se lakše kloniraju pomoću bakteriofaga, retrovirusa ili drugih virusnih vektora ili kosmida u postupku koji se zove transdukcija. Phage ili virusni vektori se često koriste u regenerativnoj medicini, ali mogu izazvati unošenje DNK u dijelove naših hromozoma tamo gde to ne želimo, uzrokujući komplikacije i čak rak.
07 Metode izbora transgenih organizama
Nisu sve ćelije preuzele DNK tokom transformacije. Od suštinskog je značaja da postoji metod otkrivanja onih koji rade. Generalno, plazmidi nose gene za otpornost na antibiotike, a transgene ćelije mogu biti odabrane na osnovu ekspresije tih gena i njihove sposobnosti da raste na medijima koji sadrže taj antibiotik. Alternativne metode selekcije zavise od prisustva drugih reporter proteina kao što su x-gal / lacZ sistem ili zeleni fluorescentni protein, koji omogućavaju selekciju zasnovanu na boji i fluorescenciji, respektivno.