Šta PCR ima da radi sa DNK sekvenciranjem i amplifikacijskim genima
Polimerazna lančana reakcija ( PCR ) je molekularna genetička tehnika za pravljenje višestrukih kopija gena i takođe je deo procesa sekvencioniranja gena.
Kako funkcionira reakcija lanca polimeraze?
Kopije gena se izrađuju pomoću uzorka DNK, a tehnologija je dovoljno dobra da napravi više kopija iz jedne kopije gena koja se nalazi u uzorku. PCR amplifikacija gena radi milion kopija, omogućava otkrivanje i identifikaciju genskih sekvenci koristeći vizuelne tehnike zasnovane na veličini i punjenju (+ ili -) komada DNK.
U kontrolisanim uslovima, mali segmenti DNK generišu enzimi poznati kao DNK polimeraze, koji dodaju komplementarne deoksinukleotide (dNTPs) na komad DNK poznat kao "šablon". Čak i manji dijelovi DNK, zvani "prajmeri", koriste se kao polazna tačka za polimerazu. Osnovni premazi su mali čovekovi delovi DNK (oligomeri), obično između 15 i 30 nukleotida. Napravljeni su poznavanjem ili ugrožavanjem kratkih DNK sekvenci na samim krajevima gena koji se pojačavaju. Tokom PCR-a, DNK koja se sekvencira zagreva se i dvostruke pramene odvajaju. Po hlađenju, prajmeri se vezuju za šablon (nazvan annealing) i kreiraju mesto za polimerazu.
PCR tehnika
Polimerazna lančana reakcija (PCR) omogućena je otkrivanjem termofila i termofilnih polimeraznih enzima (enzimi koji održavaju strukturalni integritet i funkcionalnost nakon zagrevanja na visokim temperaturama).
Koraci uključeni u PCR tehniku su sledeći:
- Stvorena je mešavina, sa optimizovanim koncentracijama DNK šablona, enzima polimeraze, prajmera i dNTP. Sposobnost zagrijavanja smeše bez denaturacije enzima dopušta denaturiranje dvostruke spirale uzorka DNK na temperaturama u rasponu od 94 stepeni Celzijusa.
- Nakon denaturacije, uzorak se ohladi na umjereniji opseg, oko 54 stepeni, što olakšava žarenje (vezivanje) prajmera na jednosmerne DNK šablone.
- U trećem koraku ciklusa, uzorak se ponovo zagreva na 72 stepena, idealna temperatura za Taq DNK polimerazu, za izduženje. Tokom izduženja, DNK polimeraza koristi prvobitnu jednoličnu DNK kao matricu za dodavanje komplementarnih dNTP-a na 3 'krajeve svakog prajmera i generiše deo dvostruke DNA u regionu gena od interesa.
- Primere koje su žarile na DNK sekvence koje nisu tačna podudarnost ne ostanu žareni na 72 stepeni, pa ograničavaju istezanje na gen koji je interesantan.
Ovaj proces denaturiranja, žarenja i izduženja se ponavlja višestrukim (30-40) puta, čime eksponentno povećava broj kopija željenog gena u smeši. Iako bi ovaj proces bio prilično dosadan ako se izvrši ručno, uzorci se mogu pripremiti i inkubirati u programabilnom Thermocycler, koji je sada uobičajen u većini molekularnih laboratorija, a potpuna PCR reakcija može se obaviti za 3-4 sata.
Svaki denaturni korak zaustavlja proces elongacije prethodnog ciklusa, čime skraćuje novu vezu DNK i zadržava ga približno na veličini željenog gena.
Trajanje ciklusa produženja može biti duže ili kraće u zavisnosti od veličine gena od interesa, ali na kraju, kroz ponovljene cikluse PCR-a, većina šablona će biti ograničena samo na veličinu gena od interesa samo zato što biće proizvedeni od proizvoda oba prajmera.
Postoji nekoliko različitih faktora za uspešan PCR koji se može manipulisati kako bi se poboljšali rezultati. Najčešće korišćena metoda za testiranje prisustva PCR proizvoda je elektroforeza agaroznog gela . Koji se koristi za odvajanje fragmenta DNK zasnovanih na veličini i naboju. Delovi se zatim vizualizuju pomoću boja ili radioizotopa.
Evolucija
Od otkrivanja PCR-a, pronađene su DNK polimeraze koje nisu originalni Taq. Neke od njih imaju bolju sposobnost "korekture" ili su stabilnije na višim temperaturama, čime se poboljšava specifičnost PCR-a i smanjuje greške prilikom ubacivanja netačnog dNTP-a.
Neke varijacije PCR-a su dizajnirane za specifične primjene i sada se redovno koriste u molekularnim genetskim laboratorijama. Neke od njih su PCR PCR i Reverse-Transcriptase PCR u realnom vremenu. Otkriće PCR-a takođe dovodi do razvoja sekvenciranja DNK, otiske prstiju DNA i drugih molekularnih tehnika.