Stepen potrebnog čistoće proteina zavisi od predviđene krajnje upotrebe proteina.
Za neke primjene dovoljan je surovi ekstrakt. Međutim, za druge namene, kao što su hrana i farmaceutski proizvodi, neophodan je visok nivo čistoće. Da bi se postiglo ovo, obično se koriste neke metode prečišćavanja proteina, u nizu koraka prečišćavanja.
Svaki korak prečišćavanja proteina obično rezultira u određenom stepenu gubitka proizvoda. Dakle, idealna strategija prečišćavanja proteina je ona u kojoj se postiže najveći nivo prečišćavanja u najmanjim koracima. Odabir koraka koje treba koristiti zavisi od veličine, nabojke, rastvorljivosti i drugih svojstava ciljnog proteina. Sledeće tehnike su najprikladnije za prečišćavanje pojedinačnog citosolnog proteina. Prečišćavanje kompleksa citosolnih proteina je komplikovanije i obično zahtijeva primjenu različitih metoda.
Prvi koraci za pročišćavanje proteina
Prvi korak u prečišćavanju intracelularnih (unutar ćelijskih) proteina je priprema sirovog ekstrakta .
Ekstrakt će sadržati kompleksnu mešavinu svih proteina iz ćelijske citoplazme, kao i neke dodatne makromolekule, kofaktore i hranljive materije. Sirovi ekstrakt se može koristiti za neke primene u biotehnologiji, međutim, ako je čistoća problem, sledeći koraci prečišćavanja moraju se pratiti.
Sirovi proteinski ekstrakti se pripremaju uklanjanjem ćelijskog ostatka stvorenog lizom ćelija, što se postiže korišćenjem hemikalija i enzima , ultrazvukom ili francuskom štampom. Obrt se uklanja centrifugiranjem, a supernatant se oporavlja. Sirove preparate ekstracelularnih proteina mogu se dobiti jednostavnim uklanjanjem ćelija centrifugiranjem.
Za određene primene u biotehnologiji postoji potreba za termostabilnim enzimima : Enzimi koji mogu tolerisati visoke temperature bez denaturiranja i zadržavajući visoku specifičnu aktivnost. Organizmi koji ih proizvode ponekad nazivaju ekstremofili. Jednostavan pristup prečišćavanju toplotno otpornog proteina je da se denaturira druge proteine u smeši zagrevanjem, a zatim ohladi rastvor (omogućavajući tako da se termostabilni enzim reformiše ili ponovo otopi, ako je potrebno. Denaturirani proteini se zatim mogu ukloniti centrifugiranjem.
Srednji koraci prečišćavanja
U prošlosti, uobičajeni drugi korak za prečišćavanje proteina iz sirovog ekstrakta bio je padavina u rastvoru sa visokom osmotskom jačinom (npr. Soli). Nukleinske kiseline u sirovom ekstraktu mogu se ukloniti precipitacijom agregata formiranih streptomicin sulfatom ili protamin sulfatom.
Precipitacija proteina se obično vrši pomoću amonijum sulfata kao soli.
Različiti proteini će precipitirati u različitim koncentracijama amonijum sulfata . Generalno, proteini sa višom molekulskom težinom precipitiraju u nižim koncentracijama amonijum sulfata. Padavina soli obično ne dovodi do visoko prečišćenog proteina, ali može pomoći u uklanjanju nekih neželjenih proteina u smeši i koncentriranju uzorka. Soli u rastvoru se zatim uklanjaju putem dijalize kroz poroznu cjelovitnu cevčicu, filtraciju ili gelsku isključivnu hromatografiju.
Savremeni biotehnološki protokoli često iskorišćavaju mnoge komercijalne dostupne komplete koji pružaju gotova rešenja za standardne procedure. Čišćenje proteina često se vrši pomoću filtera i pripremljenih kolutova za gel filtriranje. Sve što treba da uradite je da pratite uputstva i dodate pravu zapreminu odgovarajućeg rešenja i sačekajte određeno vreme dok sakupljate eluent (što izlazi na drugom kraju kolone) u svežu epruvetu.
- Hromatografske metode se mogu primeniti pomoću stubova na vrhu ili automatizovanoj HPLC opremi. Separacija pomoću HPLC-a može se vršiti metodama reverzne faze, jonske razmene ili isključivanja veličine i uzorcima detektovanih pomoću dioda ili laserske tehnologije. -
Vizualizacija proteina i procena prečišćavanja
- Hromatografija sa reversnom fazom (RPC) razdvaja proteine na osnovu njihove relativne hidrofobnosti . Ova tehnika je visoko selektivna, ali zahteva upotrebu organskih rastvarača. Neki proteini trajno su denaturirani rastvaračima i izgubit će funkcionalnost tokom RPC-a. Zbog toga se ova metoda ne preporučuje za sve aplikacije, naročito ako je neophodno da ciljani protein zadrži aktivnost.
- Jonska hromatografija se odnosi na odvajanje proteina na bazi punjenja . Kolone mogu biti pripremljene za razmjenu anjona ili razmjenu kationa. Kolone za razmjenu aniona sadrže stacionarnu fazu sa pozitivnim punjenjem koja privlači negativno napunjene proteine. Kolone za razmjenu kationa su obrnuti, negativno nabijeni perli koji privlače pozitivno napunjene proteine. Elucija ciljnih proteina se vrši promenom pH u koloni, što rezultira promjenom ili neutralizacijom zaručenih funkcionalnih grupa svakog proteina.
- Hromatografija veličine isključivanja ( gel filtracija ) odvaja veće proteine od malih, pošto veći molekuli putuju brže preko unakrsnog polimera u koloni hromatografije. Veliki proteini se ne uklapaju u poreove polimera, dok manje proteine rade i traju duže da prolaze kroz hromatografsku kolonu, preko manje direktne rute. Eluat se sakuplja u nizu cevi koje razdvajaju proteine na osnovu vremena elucije. Filtracija gela je korisno sredstvo za koncentraciju uzorka proteina jer se ciljni protein sakuplja u manjoj volumeni elucije nego što je inicijalno dodato u kolonu. Slične tehnike filtriranja mogu se koristiti tokom proizvodnje velikih količina proteina zbog njihove troškovne efikasnosti.
- Afinitetna hromatografija je veoma korisna tehnika za "poliranje" ili dovršavanje procesa prečišćavanja proteina. Perle u koloni hromatografije su ukrštene na ligande koji se specifično vezuju za ciljni protein. Protein se zatim uklanja iz kolone ispiranjem rastvora koji sadrži slobodne ligande. Ovaj metod daje najčistije rezultate i najvišu specifičnu aktivnost u poređenju sa drugim tehnikama.
- SDS-PAGE je elektroforeza poliakrilamidne gelove, izvedena u prisustvu SDS (natrijum dodecil sulfata) koja se vezuje za proteine dajući im veliki negativan naboj. Pošto su cene svih proteina prilično jednake, ova metoda ih razdvaja gotovo u potpunosti zasnovana na veličini. SDS-PAGE se često koristi za testiranje čistoće proteina nakon svakog koraka u nizu. Kako se neželjeni proteini postepeno uklanjaju iz mešavine, smanjuje se broj zona prikazanih na SDS-PAGE gelu, dok ne postoji samo jedan opseg koji predstavlja željeni protein.
- Imunoblotiranje je tehnika vizualizacije proteina primenjena u kombinaciji sa afinitetnom hromatografijom. Antitela za određeni protein se koriste kao ligandi na koloni afinitetne hromatografije. Ciljni protein se zadržava na koloni, a zatim uklanja ispiranjem kolone rastvorom soli ili drugim agensima. Antibodije povezane sa radioaktivnim ili etiketama za boju pomažu u detekciji ciljane proteine kada se odvoji od ostatka mešavine.
Izvori:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., Njujork, Njujork, Sjedinjene Američke Države.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Priručnik za prečišćavanje proteina, izdanje AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Sjedinjene Američke Države. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.