Prilagođavanje bilo kojoj od komponenti reakcije lanca polimeraze (PCR) može promijeniti kvalitet ishoda, bilo poboljšanjem ili smanjenjem prinosa i kvaliteta proizvoda ili poboljšanjem specifičnosti reakcije i osjetljivosti. Parametri koji utiču na krajnji rezultat mogu biti fizički (tj. Temperatura, vreme ciklusa) ili hemijska (tj. Koncentracija šablona, vrsta enzima koji se koristi). Sledeći su nekoliko ključnih faktora koji utiču na uspeh PCR-a.
01 Čisti laboratorijski uslovi
Pošto je PCR sposoban da detektuje jedinstveni molekul DNK, važno je održavati čiste uslove u laboratoriji. Uvijek nosite svježe rukavice, koristite sterilnu posudu od stakla, cijevi i pipete i sterilna rješenja i očistite radno područje prije početka rada.
Uvek uključite kontrolne reakcije, bez DNK i bez enzima, kako bi se osiguralo da su rezultati zaista zahvaljujući pojačanju pravog uzorka.
Većina ljudi obavezno ima sopstveni skup rešenja koji se ne dele za lakše rešavanje problema, a određene pipete često se izdvajaju samo za PCR. PNR cevi bez DNase i RNase, otporne na aerosol vrhove pipeta i rad na udubljenju sa UV zračenjem su takođe načini za minimiziranje problema.
02 Hemijske komponente
- Imajte 18 do 24 baze
- Nemaju sekundarnu strukturu (npr. Petlje za šišmiš)
- Imajte uravnoteženu raspodelu G / C i A / T parova
- Nisu komplementarni jedni na druge na krajevima od tri stope
- Temperature topljenja (Tm) oko 5-10 stepeni Celzija ispod temperature žarenja, koja je obično između 55 i 65 stepeni Celzija
Tm za oba prajmera takođe treba da bude sličan za najbolje rezultate.
03 Reakciona mešavina: Šablon i prajmeri
Optimalne koncentracije prajmera su između 0,1 i 0,6 mikromola / l. Količina šablona varira u zavisnosti od vrste DNK (ljudskog, bakterijskog, plazmida).
Uz vrlo niske količine predložaka, postoje i druge strategije za poboljšanje rezultata, kao što su povećani brojevi ciklusa ili upotreba "vrućeg starta". Uvek testirajte nove prajmere sa pozitivnom kontrolnom reakcijom, kako biste bili sigurni da rade pod vašim specifičnim eksperimentalnim uslovima.
04 Reakciona mešavina: Enzimska aktivnost
Koncentracija MgCl2 u reakcionoj mešavini može uticati na ishod PCR i može igrati važnu ulogu u hitnijim reakcijama. Magnezijum kation oblikuje rastvorljive komplekse sa dNTPs da bi proizvela stvarni supstrat koji prepoznaje polimerazni enzim.
Jednake količine svih četiri dNTP-a takođe pomažu u smanjenju stope greške polimeraze. Određeni aditivi kao što su betain, BSA, deterdženti, DMSO, glicerol i pirofosfataza takođe mogu uticati na specifičnost enzima ili efikasnost reakcije.
05 Tip termocikla
Kada kupujete laboratorijsku opremu, imajte na umu da su neki termocikli manje precizniji od drugih pri održavanju tačnih, željenih temperatura.
Ovo je jedno područje gdje se jeftino neće dugo isplatiti kada se suočite s finickom reakcijom ili primjenom prajmera koji zahtijevaju uski raspon temperature za žarenje.
Reakcione cijevi tankih zidova dizajnirane tako da odgovaraju tahom brendu termocikla koji koristite, također pomažu u optimizaciji reakcionih temperatura.
06 Postavke ciklusa
Povećanje prinosa se može postići povećanjem vremena produženja oko svakih 20 ciklusa, kako bi se kompenzovao manji enzim da bi se pojačalo više šablona. Obično je manje od 40 ciklusa dovoljno za amplifikaciju manje od 10 molekula template-a na dovoljno koncentraciju da bi se pogledao na agarzni gel sa obojenim etidijumom bromidom.