DNK sekvenciranje takođe zavisi od naše sposobnosti da koristimo gel elektroforezu za razdvajanje ćelija DNK koje se razlikuju po veličini za samo jedan bazni par.
DNK sekvenciranje
Krajem 1970-ih, izumljene su dve tehnike sekvenciranja DNK za duže molekule DNK. To su metoda Sanger (ili dideoxy) i metoda Maxam-Gilbert (hemijsko cepanje). Metoda Maxam-Gilbert zasnovana je na nukleotidno specifičnom cepanju hemikalija i najbolje se koristi za sekvenciranje oligonukleotida (kratki nukleotidni polimeri, obično manji od 50 baznih parova dužine). Metoda Sanger se češće koristi jer se dokazano tehnički lakše primjenjuje, a uz pojavu PCR-a i automatizaciju tehnike lako se primjenjuje na duge strune DNK uključujući i neke čitave gene. Ova tehnika zasnovana je na završetku lanca pomoću dideoxinukleotida tokom reakcija prozračnosti PCR-a.
Sangerov metod
U Sangerovoj metodi, DNK žica koja se analizira koristi se kao šablon, a DNK polimeraza se koristi, u PCR reakciji, da generiše besplatne žice koristeći prajmere.
Pripremljene su četiri različite PCR reakcione mešavine, od kojih svaka sadrži određeni procenat analoga dideoxinukloksid trifosfata (ddNTP) sa jednim od četiri nukleotida (ATP, CTP, GTP ili TTP). Sinteza nove DNK žice se nastavlja sve dok se ne uključi jedan od ovih analoga, pri čemu je prepreka preokrenuta.
Svaka PCR reakcija će završiti sa mešavinom različitih dužina DNK žica, a sve se završava sa nukleotidom koji je dideooksi označen za tu reakciju. Gelova elektroforeza se zatim koristi za razdvajanje ćelija četiri reakcije, u četiri odvojene trake i određuje sekvencu prvobitnog šablona zasnovanog na tome koja dužina krila završava sa kojim nukleotidom.
U automatizovanoj Sangerovoj reakciji koriste se prajmeri koji su označeni sa četiri različite obojene fluorescentne oznake. PCR reakcije, u prisustvu različitih dideoxy nukleotida, se izvode kako je gore opisano. Međutim, sledeće, četiri reakcione smeše se onda kombinuju i nanose na jednu traku gela. Boja svakog fragmenta se detektuje pomoću laserskog zraka, a informacije se sakuplja pomoću računara koji generiše hromatograme koji prikazuju vrhove za svaku boju, od koje se može odrediti sekvenca DNK sekvence.
Tipično, automatska metoda sekvenciranja je tačna samo za sekvence do maksimalno 700-800 baznih parova u dužini. Međutim, moguće je dobiti punu sekvencu većih gena i, zapravo, čitavih genomova, koristeći stepenične metode kao što su Primjer Walking i Shotgun sequencing.
U Primer Walk , radni deo većeg gena se sekvencira korišćenjem metode Sanger. Novi prajmeri se generišu iz pouzdanog segmenta sekvence i koriste se za nastavak sekvenciranja dela gena koji je bio van dometa originalnih reakcija.
Sekvenciranje puške podrazumeva nasumično sečenje DNK segmenta interesa u odgovarajuće fragmente koji se mogu upravljati veličinom, sekvenciranje svakog fragmenta i uređivanje delova zasnovanih na preklapajućim sekvencama. Ova tehnika je olakšana primenom računarskog softvera za uređivanje preklapanja komada.